Por que a fabricação e as diretrizes regulatórias das vacinas de mRNA são importantes

Gostaria de começar com um lembrete que muitas vezes se perde nas discussões públicas: As vacinas de mRNA contra a Covid são produtos médicos verdadeiramente inovadores.

Antes das autorizações de uso emergencial em 2020, a tecnologia de vacinas de mRNA nunca havia sido utilizada em larga escala em humanos. Apenas dois ensaios clínicos, um da Pfizer-BioNTech e outro da Moderna, haviam testado essa plataforma em pessoas. Ao todo, aproximadamente 37,000 indivíduos receberam uma vacina de mRNA na história da medicina (sem incluir a experiência anterior com vacinas contra raiva, citomegalovírus e câncer, limitada a estudos iniciais muito menores). Isso não é uma crítica; é simplesmente uma constatação. Mas significa que o perfil de segurança a longo prazo desses produtos era, e continua sendo, incompleto.

O que se segue é familiar a quase todos os biólogos moleculares. É complexo, mas tentarei simplificá-lo, dada a sua importância. É fundamental apresentar claramente a estrutura molecular para todos, pois a forma como essas vacinas são produzidas determina diretamente o conteúdo do frasco.. E o conteúdo do frasco, uma vez injetado, percorrerá todo o corpo e ativará uma série de eventos que podem levar a problemas de saúde a longo prazo.

A transcrição in vitro não é apenas um detalhe de fabricação.

As vacinas de mRNA modificadas são produzidas usando um processo chamado transcrição in vitro (IVT).)A IVT é o método utilizado para sintetizar o mRNA modificado que, em última análise, se torna o ingrediente ativo da vacina.

Isso não é um detalhe técnico trivial. A IVT molda fundamentalmente a composição molecular do produto final.

Cientistas da BioNTech, incluindo aqueles diretamente envolvidos no desenvolvimento da vacina da Pfizer, publicaram uma análise detalhada.1 Descrevendo como as reações de transcrição in vitro (IVT) geram não apenas o mRNA de comprimento total desejado, mas também uma série de subprodutos e impurezas, como estes são normalmente removidos e quais podem ser suas consequências biológicas caso persistam. Essas instruções de fabricação, juntamente com os subprodutos que elas criam, também foram descritas em detalhes pela Moderna em suas patentes (US10,653,712 B2 e US10,077,439 B2). Mas, mais importante, essa biologia molecular já estava bem estabelecida muito antes da Covid-19. Nada disso é especulativo.

O material inicial: moldes de DNA

Essencialmente, uma reação de IVT começa com DNA de fita dupla que codifica a proteína desejada. Neste caso, a proteína spike do SARS-CoV-2.

A sequência codificadora da proteína spike usada em vacinas de mRNA é modificado geneticamente Para melhorar a estabilidade e a tolerância celular, foram feitas duas substituições de aminoácidos que a diferenciam da proteína spike viral. Essa modificação é intencional.

O próprio molde de DNA pode assumir diferentes formas. Durante os primeiros ensaios clínicos da Pfizer, foram utilizados fragmentos de DNA gerados por PCR. No entanto, o processo de fabricação comercial baseou-se em DNA derivado de plasmídeos. Isso é importante porque os plasmídeos contêm sequências regulatórias adicionais. No caso da Pfizer, essas sequências incluem elementos como o promotor SV40 e sequências ori, o que gera preocupações caso entrem em células humanas.

Uma vez que esse molde de DNA é adicionado à reação de IVT, juntamente com a RNA polimerase e outros componentes, ele é transcrito em mRNA (Figura 1).

Embora o resultado desejado da IVT seja o produto de mRNA de comprimento total pretendido, o resultado real é mais complexo. Estes incluem vários subprodutos na forma de (1) várias espécies de RNA, incluindo RNA de fita dupla (dsRNA), (2) DNA ligado ao RNA (híbridos RNA-DNA) e (3) o DNA livre do molde original (Figura 2).

A formação desses subprodutos é bem documentada e inevitável, e é por isso que a purificação subsequente é absolutamente essencial para a segurança.

A purificação tem limitações conhecidas.

Após a fabricação, são necessárias duas etapas de purificação para remover primeiro o DNA e depois os subprodutos de RNA (Figura 3):

Para remover o DNA, adiciona-se à mistura de reação uma enzima chamada DNase I, comumente usada para degradar DNA contaminante. Embora a DNase I seja eficaz contra o DNA livre, diversos estudos, incluindo trabalhos dos próprios cientistas da BioNTech, mostram que ela é ineficiente na remoção do DNA ligado ao RNA (híbridos RNA-DNA).

Essa limitação não é controversa. Ela está documentada na literatura.

O que análises independentes demonstraram

Esse contexto é crucial para a interpretação de análises independentes recentes de frascos de vacina finalizados.

Pesquisadores3 e reguladores4 Relataram a detecção de contaminantes de DNA em praticamente todos os frascos testados. Esses contaminantes incluíam tanto DNA de fita dupla quanto híbridos de RNA-DNA que se mostraram resistentes à digestão por DNase I.

Em algumas amostras, o DNA que codifica a proteína spike estava presente em níveis mais de 100 vezes superiores aos de outras sequências de plasmídeos.5, sugerindo digestão irregular ou incompleta. Análises de sequenciamento e PCR quantitativa detectaram ainda fragmentos de DNA com comprimento médio de ~200 pares de bases, alguns com mais de 4 quilobases. Em vários casos, foram observadas sequências que abrangiam quase todo o plasmídeo.

Em conjunto, essas descobertas levantam sérias questões sobre a consistência e a completude da purificação durante a fabricação em larga escala, bem como sobre as potenciais consequências biológicas dos ácidos nucleicos residuais em seres humanos.

Por que os contaminantes de ácidos nucleicos são importantes biologicamente

O RNA e o DNA são potentes ativadores das vias da imunidade inata. Isso não é especulativo. Os receptores de reconhecimento de padrões e a via cGAS-STING respondem de forma robusta a ácidos nucleicos estranhos, desencadeando inflamação, inibição do crescimento e até mesmo morte celular.

São precisamente esses mecanismos que explicam por que os produtos de terapia genética estão sujeitos a uma rigorosa supervisão de segurança.

Ironicamente, as vacinas de mRNA contra a Covid foram projetadas com modificações específicas para reduzir essa potente ativação da imunidade inata. Mas híbridos de RNA-DNA e fragmentos de DNA ainda provocarão fortes respostas imunes, apesar dessas modificações.

A persistência levanta novas questões.

Atualmente, existem evidências substanciais que demonstram que o mRNA e a proteína spike persistem nos tecidos humanos por semanas, meses e até anos após a vacinação (Tabela 1).

Ainda não sabemos se essa persistência reflete a estabilidade prolongada do mRNA, a tradução contínua ou mecanismos baseados no DNA. Mas, dada a plausibilidade da integração do DNA e a presença de DNA plasmídico não integrado de longa duração em células musculares,6 Não é descabido supor que a persistência do mRNA da proteína Spike, da proteína e dos anticorpos contra a Spike anos após a vacinação esteja relacionada às impurezas e subprodutos do DNA resultantes da IVT (imunotransfusão in vitro).

Implicações de segurança a curto e longo prazo

Em conjunto, esses dados levantam diversas considerações importantes de segurança.

Em primeiro lugar, reações imunes agudas, incluindo tempestades de citocinas e anafilaxia, foram relatadas imediatamente após a vacinação. Essas fortes respostas inflamatórias não devem ser descartadas de imediato como não relacionadas a impurezas, especialmente considerando o que se sabe sobre a ativação imune induzida por ácidos nucleicos.

Em segundo lugar, e mais criticamente, estão os riscos a longo prazo. A expressão persistente da proteína spike poderia plausivelmente contribuir para síndromes imunológicas crônicas. Ainda mais preocupante é a possibilidade de integração do DNA, que acarreta riscos de mutagênese insercional ou disrupção gênica. Isso significa um risco de câncer ou defeitos de desenvolvimento, dependendo de onde e em que idade o DNA foi integrado.

Notavelmente, a própria FDA afirma em suas fichas informativas que essas vacinas não foram testadas. Foram avaliadas quanto à carcinogenicidade (formação de câncer) ou genotoxicidade (danos ao DNA), um ponto que seria rotineiro e esperado na supervisão da terapia gênica, onde o monitoramento a longo prazo é padrão.

A lacuna regulatória em torno do DNA nas vacinas de mRNA

Como já não há dúvidas de que ainda existem resíduos de DNA em vacinas de mRNA, a questão é se as diretrizes e os limites de segurança atuais são adequados para essas vacinas. Fomos assegurados de que os subprodutos de DNA estão dentro dos limites estabelecidos pelas normas regulatórias. Então, qual é a orientação da FDA em relação a subprodutos e contaminantes de DNA? 

A orientação mais citada da FDA sobre DNA residual (≤10 ng por dose) foi desenvolvida para vacinas virais produzidas em células vivas, que são fragmentadas e "nuas", com capacidade limitada de penetrar em células humanas. No entanto, as vacinas de mRNA não são produzidas em células, seu DNA residual não é derivado da célula hospedeira e, mais importante, o DNA nas vacinas de mRNA não está nu. Ele está associado a sistemas de administração de LNP (nanopartículas lipídicas), que facilitam muito a entrada do DNA nas células. A orientação da FDA de 2010 é clara ao afirmar que não estabelece um limite de segurança relevante para o DNA associado a produtos baseados em LNP.

Outra orientação frequentemente citada é a da OMS para terapias com proteínas recombinantes que abordam o DNA residual em produtos como anticorpos monoclonais ou hormônios produzidos em células geneticamente modificadas. Nesse caso, o DNA residual se origina de células hospedeiras ou plasmídeos de expressão, está presente como traços de DNA não encapsulado (nu) e o produto final é uma proteína purificada, não uma terapia baseada em ácido nucleico (vacina de mRNA). Portanto, essa orientação não se aplica a vacinas de mRNA.

Nem as normas regulamentares da FDA nem as da OMS mais frequentemente citadas para o DNA residual foram Desenvolvidas para vacinas de mRNA, e não abordam diretamente essa questão de segurança.

O que a OMS disse sobre as vacinas de mRNA — após a implementação

Em 2022, a Organização Mundial da Saúde publicou orientações específicas sobre vacinas de mRNA.7Notavelmente, este documento foi divulgado. depois de a implementação global desses produtos. Especificamente, afirma que essa orientação foi uma resposta a: “As questões de segurança, produção e regulamentação associadas a essa nova tecnologia.O documento também faz diversas afirmações importantes:

"Como ainda não existem informações detalhadas disponíveis sobre os métodos utilizados na produção, os controles ainda não foram padronizados para vacinas de mRNA seguras e eficazes, e certos detalhes permanecem confidenciais e, portanto, não são de domínio público, não é viável desenvolver diretrizes ou recomendações internacionais específicas neste momento."

Afirma ainda: “Os procedimentos detalhados de produção e controle... devem ser discutidos e aprovados pela NRA [Autoridade Reguladora Nacional].] Caso a caso, será analisado individualmente."

A OMS reconhece que os controles para vacinas de mRNA ainda não foram padronizados e que não foi viável estabelecer diretrizes ou recomendações internacionais específicas. Além disso, é necessária a supervisão regulatória para a avaliação caso a caso pelas autoridades nacionais. 

Isso foi declarado após a implementação das vacinas de mRNA..

Até o momento da redação deste artigo, a FDA ainda não estabeleceu diretrizes padronizadas para vacinas de mRNA nem forneceu evidências e dados de segurança que sustentem quaisquer limites para o uso de DNA em vacinas de mRNA.

Por fim, vale a pena repetir: embora a tecnologia de mRNA não seja nova, antes da Covid-19, ela era regulamentada como terapia gênica, não como uma vacina tradicional. As questões de segurança relacionadas aos subprodutos de DNA nas vacinas contra a Covid-19 serão as mesmas com qualquer vacina de mRNA, incluindo as vacinas contra gripe, VSR ou mesmo contra o câncer. 

Isso ocorre porque os produtos de mRNA são fundamentalmente diferentes. Eles precisam entrar nas células e instruí-las a produzir uma proteína estranha. Isso é diferente de qualquer outra vacina convencional que administra a proteína diretamente. Não há precedentes clínicos para essa plataforma, nem para doses repetidas. E certamente não há precedentes em escala populacional.

Nesta fase, sem pandemia, com o acúmulo de dados mecanísticos e observações clínicas, e com a proliferação de vacinas de mRNA chegando ao mercado, precisamos de transparência e envolvimento direto dos órgãos reguladores com estudos de segurança rigorosos, em particular da FDA, estabelecendo diretrizes essenciais para a fabricação desses produtos – especialmente no que diz respeito aos subprodutos de DNA.

Novas tecnologias exigem análises inovadoras – não silêncio, manipulação ou censura.

Referências

1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full

2 Webb C, Ip S, et al Mol Pharm. 2022 Apr 4;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/

3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed

4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.

5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf

6 Wang et al. (2004) – “Detecção da integração de DNA plasmídico no DNA genômico do hospedeiro após injeção intramuscular e eletroporação” (Gene Therapy, 2004). Em camundongos, DNA plasmídico nu foi injetado intramuscularmente, seguido de eletroporação para aumentar a captação. Utilizando uma PCR de alta sensibilidade em DNA genômico purificado (com separação em gel para remover formas extracromossômicas), os autores identificaram quatro eventos de integração independentes 4 semanas após a injeção. O sequenciamento de junções confirmou locais de integração aleatórios (sem pontos quentes preferenciais), consistentes com a junção de extremidades não homólogas. A frequência de integração foi baixa, mas mensurável. Esta é uma das demonstrações mais claras de eventos de integração espontânea in vivo para DNA plasmídico nu no músculo. Cabe ressaltar que este estudo utilizou a administração aprimorada de DNA por meio de eletroporação, que pode ser comparada à administração aprimorada por meio de LNPs.

Martin et al. (1999) – “Vacina de DNA plasmídico contra malária: o potencial de integração genômica após injeção intramuscular” (Terapia Gênica Humana). Este estudo inicial testou a injeção intramuscular de DNA plasmídico em camundongos e utilizou hibridização de Southern blot e PCR em DNA genômico de alto peso molecular para investigar a integração. Embora a persistência tenha sido principalmente extracromossômica, os autores relataram evidências sugestivas de integração rara em algumas amostras (embora não sequenciadas de forma tão definitiva quanto em trabalhos posteriores). O estudo estabeleceu um parâmetro de baixo risco, mas reconheceu o potencial para eventos de frequência muito baixa, influenciando as diretrizes subsequentes da FDA sobre vacinas de DNA.

Ledwith et al. (2000) – “Vacinas de DNA plasmídico: Investigação da integração no DNA celular do hospedeiro após injeção intramuscular em camundongos” (Intervirology). O DNA plasmídico nu injetado por via intramuscular em camundongos mostrou que, embora nenhuma integração detectável tenha sido observada, o DNA ainda foi detectado no músculo quadríceps por até 26 semanas. O DNA era extracromossômico.

7 Comitê de Especialistas em Padronização Biológica da OMS, 74º Relatório, Anexo 3. Avaliação da qualidade, segurança e eficácia das vacinas de RNA mensageiro para a prevenção de doenças infecciosas: considerações regulatórias https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf